用水浴鍋做腫瘤細胞軟克隆實驗

       在傳統的軟瓊脂克隆形成試驗中，細胞生長在上層含有細胞培養基的軟瓊脂中，下層軟瓊脂也與細胞培養基混合，但含有較高濃度的瓊脂。這可以防止細胞貼附在培養板上，還可以使轉化細胞形成可見的菌落。這種技術的原理是正常細胞依靠細胞與細胞外基質的接觸才能生長和分裂，相反，不管周圍環境如何，轉化細胞均具有生長和分化的能力，因此能夠以錨定獨立的方式形成菌落的細胞被認為是轉化和致癌的。下面喆圖小編介紹一種用水浴鍋做相關實驗的方法，這種方法的總體目標是以半定量和嚴格的方式測定細胞的這種能力。

        實驗操作：

準備材料和試劑：

1、配制2×培養基：1 g培養基粉末，0.2 g碳酸氫鈉，加入去離子水，定容到50 mL。

2、將培養基經0.2 μm濾膜過濾除菌。

3、加入目標細胞所需培養基的其他成分。例如：用RPMI 1640培養基培養CMT 167細胞需要加入10% FBS，1% 青霉素/鏈霉素。使用之前將培養基放在37°C水浴鍋中。

4、配制1×培養基，依照目標細胞生長所需培養基配制。

5、配制1%瓊脂：1 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。

6、配制0.6%瓊脂：0.6 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。

7、將配好的瓊脂經高溫高壓滅菌，滅菌后可放在4°C保存，使用前加熱至*溶解。

8、配制氯化硝基四氮唑藍試劑：1 mg/mL氯化硝基四氮唑藍加入到1×PBS中。

        鋪下膠：

1、將熔化的1%瓊脂溶液和預熱的2×培養基放入裝滿熱水（42°C）的桶（或水浴鍋）中，在熱水里放一個50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺內。

2、6孔板中的每個孔需要加入1.5 mL混合的瓊脂和培養基，為保證足夠的量，一個6孔板準備12 mL。

3、首先加入6 mL的培養液到50 mL的錐形管，再加入6 mL的1%瓊脂溶液。將錐形管多次翻轉混勻，每個孔中迅速加入1.5 mL混合液，加混合液時不能產生氣泡。

4、室溫靜置30 min，待下膠凝固。

        鋪上膠：

1、收獲的細胞用胰蛋白酶消化，用培養基以1:5的比例稀釋（如1 mL胰蛋白酶，加4 mL培養基），放入15 mL錐形管。

2、細胞計數：以每孔5000個細胞作為起始，并根據需要進行調整。

3、細胞懸浮液的體積需要1.5 mL。一個6孔板準備12 mL細胞懸液。

4、將熔化的0.6%瓊脂溶液放入裝有熱水（42°C）的桶中，在熱水里放一個50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺內。

5、以1:1的比例混合0.6%瓊脂溶液和細胞懸液，吸取6 mL細胞懸浮液到50 mL錐形管，再加入6 mL的0.6%瓊脂溶液。混勻后迅速加入6孔板中，每孔1.5 ml。小心避免產生氣泡。

6、室溫靜置30 min，待上膠凝固后放入細胞培養箱。

7、足夠的菌落形成所需的時間因每個細胞系而異，通常為21天左右。每星期加兩次100 g的培養基以防止干燥。

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