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    腫瘤細(xì)胞的軟瓊脂集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

    更新時(shí)間:2021-06-08點(diǎn)擊次數(shù):1284

           實(shí)驗(yàn)方法原理

           HL-60細(xì)胞是一種急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞,在體外無(wú)需加刺激因子,可在軟瓊脂培養(yǎng)基中形成集落。二甲基亞砜是一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑,經(jīng)二甲基亞砜處理后的HL-60細(xì)胞按粒系途徑定向成熟分化,同時(shí)細(xì)胞的增殖力降低,幾乎全部細(xì)胞喪失了軟瓊脂中形成集落的能力。因此,這種方法可用于細(xì)胞分化的基礎(chǔ)研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗(yàn)等方面。


     

           實(shí)驗(yàn)材料        HL-60細(xì)胞

           試劑、試劑盒        小牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液、臺(tái)盼蘭、瓊脂、二甲基亞砜

           儀器、耗材        超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、顯微鏡、培養(yǎng)瓶、吸管、酒精燈、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、多孔培養(yǎng)板


     

           實(shí)驗(yàn)步驟        

           1.  收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞,先按實(shí)驗(yàn)十三測(cè)定細(xì)胞活力,然后調(diào)整細(xì)胞濃度,制成300~1 000活細(xì)胞/ml 的細(xì)胞懸液。

           2.  取二個(gè)培養(yǎng)瓶每個(gè)瓶中加9 ml 調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液,然后各加入1 ml 3%瓊脂(已融化,在65℃水浴中放置),迅速加入,混勻。

           3.  用微量加樣器吸140 μl 二甲基亞砜(MDSO),加到一個(gè)瓶中,充分混勻,為實(shí)驗(yàn)組,另一瓶不加DMSO,為空白對(duì)照組。

           4.  取一個(gè)16 mm 多孔培養(yǎng)板,每孔加1 ml(35 mm 培養(yǎng)皿需加2 ml)細(xì)胞瓊脂懸液,勿有氣泡,將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分兩組加好,蓋上蓋并作好標(biāo)記。

           5.  在室溫放置20分鐘使細(xì)胞瓊脂懸液凝固。

           6.  然后移培養(yǎng)板或平皿于
    二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

           7.  培養(yǎng)7~10天,肉眼觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞集落。

           8.  結(jié)果:以肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞團(tuán)(含500個(gè)以上細(xì)胞)作為計(jì)數(shù)集落的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組HL-60細(xì)胞在含0.3%的軟瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好,每個(gè)孔中可見(jiàn)有多個(gè)集落形成,而實(shí)驗(yàn)組HL-60細(xì)胞因經(jīng)二甲基亞砜誘導(dǎo)分化,細(xì)胞在軟瓊脂中的集落形成明顯減少。

           9.  集落的計(jì)數(shù)和計(jì)算:

           (1)集落數(shù)=n孔中細(xì)胞集落數(shù)總和/n孔

           (2)集落形成率=集落數(shù)/接種培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)×100%

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